miRNA主要通過與靶mRNA的結合，或促使mRNA降解，或阻礙其翻譯，從而抑制目的基因的表達。用生物信息學方法準確快速地預測miRNA的靶基因，可以為研究miRNA功能提供線索。 

下面總結一些熒光素酶實驗中常見的問題。  

1轉染成功如何判斷？ 
 

共轉染的幾個質粒中，3' UTR質粒及Renilla質粒可通過zui終的luc讀值判斷是否轉染成功，而miRNA質粒或mimic的轉染情況無法從zui終的luc讀值做出判斷，因而針對miRNA，轉染是否成功可用以下方法進行： 
i.如轉入的miRNA帶熒光標記如GFP，則可直接在轉染后、細胞裂解前，顯微鏡下觀察細胞熒光； 
ii.如轉入的miRNA不帶任何熒光標記，可考慮進行miRNA的qRT-PCR檢測，通過檢測結果判斷實驗組2、4、6是否相對其對照組miRNA有顯著過表達。 
iii.設置一個熒光質粒轉染參照組，同批轉染一個組的細胞，間接反映出同批次實驗的轉染情況。  
 

2如何判斷實驗體系無異常，獲得客觀的實驗結果？ 可以從以下幾個方面來考察實驗結果的客觀性： 

對照的2個實驗組，即實驗組1與實驗組2 luc表達情況應無顯著差異； 轉染正常，質粒或mimic確保成功轉染入細胞； luc檢測值在儀器檢測線性范圍內。  
 

3 陰性結果如何理解？ 

在確保實驗體系無異常的前提下，如果zui終檢測到的結果是陰性結果，則基本可以判斷目的miRNA不能直接調控靶基因的表達，不死心的話就再做一次，如果仍然是陰性結果，死心吧。 
有的同學說我一次做出陽性結果一次做出陰性結果咋辦？那就恭喜你再重復吧，結果一直波動的話可能是實驗系統或其他原因，  
 

4為何與文獻報導有差異？ 

實驗中，我們往往會遇到無法重復出文獻中結果的問題，這是肯定的，不同實驗室實驗條件、實驗材料、實驗細節并不能確保與文獻*一致所致。因此，只要我們相信自己就行。  
 

5實驗體系是否可以優化？如何優化？

該實驗的關鍵點在細胞狀態和轉染效率，轉染效率的優化可通過調整共轉染質粒的比例或調整轉染體系來進行，設置合理的質粒轉染量梯度，觀察microRNA對靶基因的抑制是否存在劑量效應或是否存在變化趨勢的一致性，從而使結論更加可靠。  
 

6使用mimics的一些問題？ 

有的同學喜歡使用mimics來做實驗，其實mimics就是體外合成的成熟體miRNA，同樣可以反轉錄，用qRT-PCR來檢測表達量，但是大家應該很少看到有文章把mimics的過表達量PCR結果放出來的吧，那是因為mimics的過表達通常在數萬到數十萬倍，miIRNA通常會靶向結合許多靶基因，這么強的外源過表達肯定會引起嚴重的脫靶效應，給審稿人把柄質疑你嗎？對于這種找抽的行為大家肯定是積極規避的。質粒介導的miRNA過表達由于是模擬了前體在生物體內的剪切，其過表達通常在數十倍到數百倍，可能引起的脫靶效應遠沒有mimics嚴重。 
 
7是否還有其他方法驗證miRNA對靶基因表達的調控？ 

驗證miRNA對靶基因的調控，也可直接檢測miRNA過表達或下調表達后，靶基因在mRNA（qRT-PCR方法）或蛋白水平上的變化（Western Blot方法）。